Mikroskopické preparáty

Z Multimediaexpo.cz

Mikroskopické preparáty (neboli histologické preparáty) jsou určeny pro studium a buněčnou diferenciální diagnostiku živých tkání. Pro přímé histologické studium je vhodné jen velmi omezené množství živočišných tkání a buněk. K tomu, aby bylo možné studovat jednotlivé tkáně je zapotřebí zhotovit preparáty. To znamená tyto šetrně a rychle usmrtit, nařezat je na tenké řezy a obarvit.


Obsah

Fixační činidla

K rychlému usmrcení tkání se používá fixačních tekutin. Jejich jednotlivé komponenty ovlivňují výsledný obraz, protože se při kontaktu s tkání jedná o chemickou reakci. Např. HgCl2 (chlorid rťutnatý) hrubě denaturuje bílkovinné komponenty, ale dobře zachovává strukturu cytoplazmy a jádra. Naopak formaldehyd, glutaraldehyd a OsO4 (osmium tetroxid) denaturují proteinové složky velmi jemně a proto se používají pro fixaci v elektronmikroskopických studiích. Pro studium tuků a tukových látek je vhodný formaldehyd či podobná látka, která k nim není agresivní. V řadě případů je možné využít metodu freezing-drying , tj. zmrazení tkáně a její vakuové vysušení ve zmrzlém stavu.

Zalévání

Pro vznik velmi tenkých a kvalitních řezů je nutné tkáň zalít do média, které jí zpevní a vytvoří se dostatečně homogenní blok, který můžeme krájet. Pro světelné mikroskopické pozorování se zhotovují řezy tlusté 4-20 mikrometrů (μm), pro elektronmikroskopickou analýzu pak řezy o tloušťce 100 nanometrů (nm) a tenčí.
Klasicky zaléváme tkáň do parafínu, případně celloidinu (nitrocelulózy). Méně obvyklé je zmrazení zkoumaného materiálu. V elktronové mikroskopii se uplatňuje zalévání do různých epoxidových nebo polyesterových pryskyřic.
Většina těchto zálivek však není mísitelná s vodou a prto je nutné tkáň nejdříve odvodnit a nasytit rozpouštědlem, ve kterém se zálivka rozpustí. Obvykle je dehydratační proces realizován stoupající řadou alkoholů (etanol 70%, 80%, 90%, 96% a absolutní). Jako rozpouštědlo se nejčastěji používá (u parafinových řezů) toluen, pro celluloidin pak alkohol-éter a pro polyestery aceton. Parafín je za pokojové teploty tuhý, proto zalévanou tkáň je nutné zahřívat při teplotě cca 60oC, což snižuje aktivitu některých enzymů a smršťuje tkáň.


Krájení na mikrotomech

Samotné krájení tkáně se provádí na mikrotomech. Jedná se o jednoduché přístroje,ve kterých je nůž orientovaný v rovině proti bloku a blok je po každém řezu posouván šroubem do výšky. Pro elektronové mikroskopy jsou zhotovovány preparáty na ultramikrotomech.
Po ukrojení řezu z parafínového bloku je řez napnut na kapce vody a přilepen na podložní sklíčko. Celloidinové řezy jsou štětečkem přenášeny do 70% alkoholu, zmražené řezy pak do nádoby s destilovanou vodou. U parafinových řezů se jako lepidlo k adhezy na podložní sklíčko používá nejčastěji bílek-glycerin, jindy želatina nebo syntetická lepidla. Po nalepení musí být řezy odparafínovány a převedeny zpět do vody, aby mohly být barveny (ve většině případů).


Barviva a barvení

A. Přirozená barviva:

Prvá dvě barviva řadíme k tzv. jádrovým (bazickým), orcein má různá užití, šafrán je barvivo na kolagen tzv. kyselé.

B. Syntetická barviva:


Barvení hematoxylin-eozín

Příklad barvení hematoxylin-eozínem na preparátu endometriálního adenokarcinomu.
Nejjednodušším a nejčastějším barvením je hematoxylin-eozín. Jako hematoxylin se použije některý z řady kamencových hematoxylinů (např. Mayerův, Ehrlichův, Harrisův apod.). Kamenec je síran hlinito-draselný.
Výsledek barvení: Jádra a bazofilní struktury modré, ostatní části preparátu odstínovaně červené.


Barvení Weigertův železitý hematoxylin - van Gieson

K barvení jader se použije železitý hematoxylin a dobarvujeme kyselým fuchsinem a kys. pikrovou.
Výsledek barvení: Jádra temně hnědá, červeně kolagenní vlákna vaziva (fuchsinem) a svaly žlutě (kys. pikrovou).


Heidenhainův azan

k barvení jader se užije azokarmínu G a po moření řezů v roztoku kyseliny fosfowolframové dobarvíme směsí anilínové modře a G-oranže. Jendá se o složitou techniku.
Výsledek barvení: Červeně jádra a některá granula žláz, stejně červeně červené krvinky, modře kolagen a granula některých buněk, oranžvo-červeně svaly a zlato-oranžově granula některých buněk. Cytoplazma se často obarví bledě modře.


Modrý Massonův trichrom

kombinace barvení Regaudovým železitým hematoxilynem, kyselým fuchsinem a anilínovou modří.
Výsledek barvení: jádra jsou černá, cytoplazma většinou červená, kolagenní vlákna a mukoidní substance modré.


Žlutý Massonův trichrom

byl používán zejména v minulosti.
Výsledek barvení: jádra jsou modrá nebo černá (podle užitého hematoxylinu), cytoplazma je červená, kolagen zlatožlutý.


Barvení elastických vláken

Verhoeffův jódový hematoxylin je málo používaným barvením na elastická vlákna, které spolu s jádry zbarví černě. Používanější na elastiku je barvení orceinem , kdy vlákna jsou červenohnědá. Rezorcinfuchsin je zbarví temně fialově, aldehydfuchsin modro-fialově.


Impregnace podle Gomoriho

se používá pro zobrazení retikulárních vláken, která jsou černá a hnědá pak vlákna kolagenní. Můžeme použít i impregnaci amoniakálním roztokem stříbra.


Barvení nervového systému

používáme impregnaci neurofibril podle Bielschowskyho nebo její modifikace dle Gros-Schultzeho. Stejně tak impregnace gliových buněk podle Ramon-y-Cajala nebo dle Rio del Hortegy. Tato barvení jsou pro svou nespolehlivost nahrazována imunohistochemickými průkazy neurofibril a kyselého fibrilárního proteinu glií.


Barvení podle Pappenheima

Slouží k obarvení krevního nátěru. Užijeme dvě směsi barviv - podle May-Grünwalda (je to eozinát azuru II. rozpuštěný v metanolu) a dle Giemsy-Romanowskyho (eozinát metylenové modři a eozinát metylenazuru rozpuštěný ve směsi stejných dílů metanolu a glycerolu). Někdy jsou tato barviva označována jako neutrální. Krevní nátěr po zaschnutí překryjeme kapkami May-Grünwaldova roztoku a necháme ho působit 3 minuty (tj. fixace metanolem). Na nátěr dokapeme stejný počet kapek destilované vody o neutrálním pH a roztoky promísíme (teď dojde k barvení nátěru). Po jedné minutě zředěný roztok slijeme a nakapeme na nátěr zředěné barvivo dle Giemsy-Romanowskyho (0,3 ml barviva do 10 ml destilované vody). Necháme barvit 12-15 minut. Barvivo opět slijeme, nátěr opláchneme ústojným roztokem o neutrálním pH a usušíme na vzduchu.
Výsledek barvení: Erytrocyty jsou růžové, jaderný chromatin červenofialový, cytoplazma monocytů blankytně modrá, cytoplazma lymfocytů je také modrá, někdy temnější (pro více ribozomů), acidofilní granula eozinofilních granulocytů medová až růžová, bazofilní granula hnědá až hnědofialová, trombocyty mají hyaloméru modrou a centrální chromoméru purpurovou. V bazofilních granulocytech se nemusí zbarvit granula vůbec, protože jsou ve vodě rozpustná.

Literatura

  • Jelínek, Richard et al.:Skripta histologie, Supertext v síti 3. LF UK v Praze.
  • E. Maňáková, A. Seichertová: Metody v histologii, 1. vyd. Praha. Karolinum, 2001

Související články

Externí odkazy


Citováno z „http://ww.multimediaexpo.cz/mmecz/index.php/Mikroskopick%C3%A9_prepar%C3%A1ty“